Aurélie MOAL – Gerente de Marketing, Salud a través de la Nutrición, Adisseo
Estelle DEVILLARD – Gerente de I&D, Salud a través de la Nutrición, Adisseo
Karoline SIDELMANN BRINCH – Gerente Científica en Investigación Aplicada, Novozymes
El uso de probióticos como los Bacilli aumentó considerablemente en la producción animal en los últimos 25 años. Los probióticos son bacterias vivas que cuando se administran en cantidades adecuadas, confieren efectos fisiológicos benéficos al huésped, aportando mejoras a la salud, así como en el desempeño.
La morfología de los Bacilli y la germinación de las esporas
Los Bacillus se presentan en dos formas distintas: endosporas (esporas) y células vegetativas (germinadas), dependiendo de las condiciones ambientales. Los Bacilli son administrados a los animales como esporas en la dieta, pudiendo resistir a las condiciones desafiantes del procesamiento de la ración y de su prolongado almacenamiento.
Las esporas son metabólicamente inactivas y se forman en respuesta a tensiones ambientales, como mecanismo de sobrevivencia. Se trata de formas no reproductivas de bacterias, más duraderas y viables jamás conocidas. Las esporas son resistentes y pueden sobrevivir a la radiación UV, temperatura y presión extrema, exposición a productos químicos tóxicos y acidez.
Después de su ingesta por el animal, la espora necesita germinar y crecer para convertirse metabólicamente en activa y con ello, brindar sus beneficios al animal. La germinación se producirá en presencia de germinantes los cuales se unen a receptores específicos en la membrana interna. Las esporas de los Bacillus poseen una variedad de dichos receptores, facilitando la unión a varios tipos de germinantes, nutrientes o no nutrientes, y condiciones ambientales favorables (temperatura, pH…) (Figura 1). Cuando una señal lo suficientemente fuerte es generada, la germinación inicia. Los receptores también pueden ser inhibidos, aunque una vez completamente activados, el proceso de germinación será irreversible.
Figura 1: Germinación de esporas de Bacillus
A diferencia de las esporas, las células vegetativas se dividen, se multiplican, se comunican y son móviles. Son metabólicamente activas y producen metabolitos, brindando efectos completos del probiótico en el huésped.
¿Todos los probióticos germinan dentro del tracto digestivo de los animales?
Alterion® es el único probiótico disponible en el mercado cuya germinación ha sido demostrada y visualizada dentro de las aves.
Alterion®es una cepa exclusiva natural de Bacillus subtilis, seleccionada específicamente para fomentar el rendimiento constante en las aves. Alterion® es el resultado de una selección estricta, donde a más de 900 cepas inscritas en la AAFCO (The Association of American Feed Control Officials) se les ha dado seguimiento y han sido probadas tanto en condiciones in vitro como in vivo.
El Bacillus subtilis 29784 (Alterion®) fue seleccionado cuidadosamente para proporcionar seguridad, estabilidad, eficacia y funcionalidades superiores.
Alterion® no contiene genes de resistencia antibiótica utilizados en medicina humana y es inofensivo a las células animales. Ambos son parámetros importantes para garantizar la seguridad del producto y para preservar la salud y el bienestar de los animales.
La clasificación o triaje también se basó en varias pruebas para con ello garantizar la selección de la cepa más estable (en condiciones adversas de peletización, condiciones digestivas y almacenamiento prolongado) y más eficiente en términos de características de germinación.
Además, las esporas de Alterion® se encuentran especialmente “unidas” a partículas de carbonato de calcio. Esa innovadora formulación garantiza la reducción de la producción de polvo, la baja segregación de las esporas, evita problemas de separación y favorece una excelente fluidez y homogeneidad de la premezcla y de la ración.
La germinación de Alterion® se probó in vitro y, lo más importante, se visualizó in vivo.
Se desconoce la capacidad de la mayoría de las cepas de Bacillus para germinar y crecer in vivo. Debido a la complejidad del proceso de germinación, especialmente en un entorno muy complejo; es decir, el contenido del lumen digestivo, la confirmación in vivo de la germinación continúa siendo una desafiante tarea.
Al unir la experiencia en producción animal de Adisseo y la de soluciones biológicas de Novozymes, se logró investigar a profundidad la germinación y el crecimiento de Alterion®, utilizando una variedad de métodos innovadores complementarios, como el monitoreo in vitro, las tecnologías fluorescentes y la evaluación metabólica in vivo.
Germinación in vitro
Se seleccionó la cepa de Alterion® en función de sus capacidades superiores de germinación en condiciones intestinales y de alimentación (Figura 2).
Figura 2: Germinación de la espora de Alterion® en condiciones intestinales a 0, 4 y 6 horas
En un estudio previo, Alterion® fue cultivado in vitro junto con una variedad de componentes y aditivos para alimentos, con el fin de evaluar su impacto sobre la velocidad de germinación por medio de la densidad óptica (DO).
El perfil de germinación del Alterion® fue similar a lo largo del tiempo en evaluaciones con trigo, maíz y soya (Figura 3). Además, la inclusión de ácidos orgánicos, coccidiostatos y una variedad de aditivos no mostró impacto alguno sobre la germinación.
Igualmente, se comparó la cinética de la germinación del Alterion® in vitro con otras cepas de Bacillus. Al comparar otra cepa de Bacillus subtilis y una de Bacillus licheniformis en condiciones semejantes se demostró claramente que la cinética de la germinación varía considerablemente entre ambas cepas, mostrando así la superioridad de Alterion® (Figura 4).
Visualización de la germinación in vivo
Se observó la germinación de Alterion® por medio del desarrollo de un sistema único e innovador de dos indicadores fluorescentes, que rastrea el proceso de germinación en el intestino del ave. El primer paso consiste en la integración de marcadores fluorescentes en el genoma de Alterion®, más específicamente dos genes, uno de los cuales codifica la proteína verde fluorescente (PVF) y el otro codifica la proteína fluorescente roja (dsRed); así, se emite una señal verde para la espora adormecida y una señal roja después de la germinación y el crecimiento, respectivamente.
Posterior a la incorporación de los marcadores, se comprobó la fluorescencia a través del análisis microscópico. Se inoculó una placa con 96 pocillos con esporas de Alterion® y se observó la fluorescencia, tal como lo muestra la Figura 5. Las esporas adormecidas de Alterion® pueden visualizarse en color verde. Después de la germinación, la fluorescencia verde desapareció rápidamente y las células germinadas florecieron en rojo.
Para comprobar la germinación de Alterion® en condiciones in vivo, se llevó a cabo un estudio durante 13 días. En éste las aves fueron alimentadas con una dieta control o tratamiento, a la cual se le añadió esporas de Alterion® con doble marcación 72 horas antes del sacrificio. Al final del estudio, se muestreó el contenido del íleon, analizado y procesado por medio del InCell Analyzer para comprobar la fluorescencia de las muestras. El color rojo indica que la mayoría de las esporas germinaron y que están creciendo activamente para producir los efectos benéficos sobre la salud de pollos de engorde (Figura 6).
Producción de metabolitos in vivo
Un enfoque complementario para investigar la actividad in vivo de Alterion® después de la germinación y el crecimiento, consiste en monitorear su producción de metabolitos. Se estudiaron los metabolitos de Alterion® in vitro y se identificaron tres de ellos, producidos en cantidades altas y consistentes (niacina, pantotenato e hipoxantina). La concentración de dichos metabolitos fue posteriormente medida en el contenido digestivo de las aves alimentadas con Alterion®. El estudio demostró claramente que la concentración de los metabolitos estaba estrechamente relacionada con el número de bacilos detectados (Figura 7).
Figura 7: Porcentaje relativo de Bacillus spp. y concentración de metabolitos (heces nmol/g) en aves suplementadas con Alterion® versus aves control.
Claramente, estos datos confirman que Alterion® es activo en el intestino de las aves.
Favoreciendo la resiliencia o resistencia animal en tres líneas defensivas
La actividad metabólica de Alterion® en el intestino es responsable por los efectos benéficos in vivo sobre el desempeño, la salud y la microbiota del huésped (Jacquier et al., 2019).
Una vez germinado y activado, el Alterion® favorece la resiliencia o resistencia animal actuando en tres líneas defensivas íntimamente relacionadas: 1) promoviendo un microbioma resistente, 2) fortaleciendo la función de barrera y preservando la integridad intestinal y, finalmente, 3) garantizando un excelente control inflamatorio y de las respuestas inmunes.
Estudios in vivo demostraron que Alterion® influye positivamente las poblaciones bacterianas, resultando en un efecto benéfico en la actividad microbiana. Por ejemplo, Alterion® aumenta las poblaciones que degradan los polisacáridos, así como la de bacterias productoras de butirato (Jacquier et al., 2019).
Demostrar que Alterion® es activo también in vivo nos permite confiar en datos in vitro (Rhayat et al., 2017). Alterion® fortalece la barrera intestinal aumentando la expresión de proteínas de las “uniones estrechas o tight junctions”. Además, refuerza y controla la respuesta inflamatoria por la inhibición de la degradación de IkB, impidiendo de esta forma la translocación de NF-κB. Con ello, la expresión de compuestos proinflamatorios como la IL-8 y la enzima iNOS es controlada (Rhayat et al., 2019).
Conclusión
Las características únicas de esta cepa de Bacillus, unidas a la formulación y a su germinación adecuada, hacen que Alterion® sea metabólicamente activo donde más importa: en el intestino de las aves. Allí es donde produce sus metabolitos y actúa en tres líneas defensivas: la microbiota, la mucosa intestinal y las respuestas inflamatorias promoviendo la resiliencia o resistencia animal.
Este probiótico de efectividad científicamente comprobada brinda significativas y constantes mejoras sobre la salud intestinal, el rendimiento productivo y la utilización del alimento por parte de las aves. De esta forma, podemos utilizar los recursos naturales de una manera más responsable para mejorar la sostenibilidad de la
