Parece ser que los perros son el reservorio de genotipos de C. difficile que se asocian con enfermedades humanas y que muestran resistencia a múltiples antibióticos.
La emergencia de Clostridium difficile como agente causante de infección humana ha alimentado una creciente preocupación por el posible papel de los animales como reservorios de cepas epidémicas [1,2]. En este escenario, es fundamental una completa caracterización genética y fenotípica de los aislamientos de este anaerobio grampositivo obtenidos de poblaciones humanas y animales para confirmar la posibilidad de transmisión interespecies [3,4].
El objetivo de la presente investigación fue evaluar la prevalencia de C. difficile en perros con diversas enfermedades digestivas. Además, se determinaron el genotipo (ribotipo) y los patrones de resistencia antimicrobiana de los aislados recuperados.
Materiales y métodos
Este estudio se llevó a cabo entre abril de 2012 y mayo de 2014 en la consulta de Grastroenterología de Pequeños Animales del Hospital Clínico Veterinario de la Universidad Complutense de Madrid. Se analizó la presencia de C. difficile en un total de 107 perros (62 machos y 45 hembras) con diversos trastornos digestivos. Los animales muestreados variaron en cuanto a su raza, origen y edad. Seis perros fueron muestreados dos veces durante el periodo de estudio, lo que dio lugar a un total de 113 muestras. Se tomaron muestras de escobillones rectales para el examen clínico rutinario de cada animal y se almacenaron a -20 ºC hasta su análisis.
Detección de C. difficile
Las muestras fecales se cultivaron para el aislamiento de C. difficile mediante siembra directa con un procedimiento de enriquecimiento, tal como se describe en Blanco et al. [18]. Los aislamientos bacterianos fueron identificados como C. difficile por la morfología de sus colonias (de color amarillento a blanco, con aspecto de vidrio molido), el olor típico de este microorganismo, y una reacción positiva en un inmunoensayo específico rápido que detecta simultáneamente la producción del antígeno constitutivo glutamato deshidrogenasa (GDH) y las toxinas A y B
Resultados
C. difficile se recuperó de 13 de los 107 perros analizados (12,1 %). La epidemiología y las características clínicas de perros que produjeron cultivos fecales positivos para C. difficile se detallan en la tabla y la figura 3. Los perros positivos pertenecían a los siguientes grupos de enfermedad: enfermedad inflamatoria crónica (seis casos; 12,5 % de los animales del grupo), enfermedad aguda (tres; 11,5 %), neoplasia (dos; 20 %), enfermedad parasitaria (uno; 9,1 %) y otras condiciones digestivas (uno; 33,3 %). Un perro (P-13) mostró dos cultivos fecales positivos separados de C. difficile durante el periodo de estudio. Solo dos de las muestras que produjeron aislamientos de C. difficile en el protocolo de enriquecimiento dieron un resultado positivo por siembra directa. Cinco perros (38,5 %) que dieron cultivos positivos estaban en tratamiento con metronidazol desde 21 a 42 días antes de su admisión.
Se caracterizaron un total de 16 aislamientos (tres del perro P-13, dos del P-84 y uno de cada uno de los otros animales que dieron un cultivo positivo). Nueve aislamientos (56,3 %) fueron toxigénicos y pertenecieron a los ribotipos 078 (cinco aislamientos), 106 (dos aislamientos), 154 (un aislamiento) y 430 (un aislamiento). Los siete aislamientos restantes (43,7 %) fueron no toxigénicos y pertenecían al ribotipo 010.
Todos los aislamientos estudiados fueron susceptibles a daptomicina, rifampicina, teicoplanina, tigeciclina y vancomicina, pero mostraron resistencia de alto nivel a la levofloxacina (CMI ≥ 32 μg/ml, en todos los casos). Por otra parte, todos los aislamientos del ribotipo 010 fueron resistentes a clindamicina y eritromicina, y cinco aislamientos de diversos ribotipos (dos de 078 y uno de cada uno de 010, 106 y 154) mostraron resistencia a la moxifloxacina. Además, siete de los 16 aislamientos (43,8 %), que se habían obtenido de diferentes perros y pertenecían a los ribotipos 010 (seis aislamientos) y 106 (un aislamiento) mostraron resistencia al metronidazol tras 48 h de incubación de los ensayos de Etest. En particular, el fenotipo resistente a metronidazol parecía ser estable en todos los casos, ya que se mantuvo durante varios meses después del subcultivo de aislamientos en medio no selectivo y almacenamiento a 4 ºC y -70 ºC. Ninguno de los aislamientos estudiados mostró heterorresistencia al metronidazol (es decir, crecimiento retardado de colonias dentro de la zona de inhibición de Etest).
Pruebas de susceptibilidad antimicrobiana
La sensibilidad in vitro de los aislamientos a distintos antibióticos se determinó mediante el método de Etest y se usó Bacteroides thetaiotaomicron ATCC 29741 como cepa de control de calidad. En todos los casos, se utilizó agar Brucella suplementado con vitamina K1 y hemina como medio, y las placas a utilizar en el ensayo fueron prerreducidas mediante incubación de 24 horas a 37 °C bajo condiciones anaeróbicas.
Los antibióticos analizados y los puntos de corte para la designación de fenotipos resistentes fueron los siguientes: clindamicina (≥ 8 μg/ml), daptomicina (> 4 μg/ml), eritromicina (≥ 8 μg/ml), levofloxacino (≥ 8 μg/ml), metronidazol (≥ 32 μg/ml), moxifloxacino (≥ 8 μg/ml), rifampicina (≥4 μg/ml), teicoplanina (> 2 μg/ml), tigeciclina (> 4 μg/ml) y vancomicina (≥ 32 μg/ml) [3,20 – 23].
Las placas de ensayo se incubaron bajo condiciones anaeróbicas durante 48 h a 37 °C. La posible heterorresistencia a metronidazol se determinó de acuerdo con el procedimiento descrito por Peláez et al. [23, 24], que consiste en realizar una segunda lectura del ensayo Etest de metronidazol después de cinco días de reincubación en las mismas condiciones (37 °C, anaerobiosis). El fenotipo heterorresistente se caracteriza por la aparición de colonias de crecimiento lento por encima del punto de corte de resistencia (es decir, 32 μg/ml) dentro del halo de inhibición de un aislamiento previamente considerado susceptible.
El perro P-13 produjo diferentes ribotipos en dos muestreos (106, y 010 y 154, respectivamente). Además, la muestra fecal obtenida del perro P-84 produjo dos aislamientos del ribotipo 010 con diferencias sustanciales en su patrón de susceptibilidad tente al metronidazol mientras que el otro fue susceptible).
Discusión
La asociación entre la presencia de C. difficile y el desarrollo de diarrea y otros trastornos digestivos en los pequeños animales sigue siendo controvertida [6,15-17]. Del mismo modo, mientras que algunos autores han informado de la existencia de una asociación significativa entre la recuperación de C. difficile y el tratamiento con antibióticos [6,8], otros autores no han observado tal asociación [5,11,16].
En la población de perros analizados en este estudio, C. difficile se aisló de animales de diferentes grupos de enfermedades que estaban o no bajo tratamiento con metronidazol. Sin embargo, la asociación estadística entre las variables clínicas y microbiológicas no fue analizada, ya que esto requeriría el uso de datos obtenidos en estudios de caso-control diseñados específicamente.
Algunos de los aislamientos toxigénicos de C. difficile caracterizados en este estudio pertenecían a ribotipos que actualmente se consideran epidémicos. En particular, el ribotipo 078 se aísla con frecuencia de pacientes humanos y animales en Europa y Norteamérica, y se ha implicado en casos de infección grave [25-28]. En España, el ribotipo 078 se encuentra entre los más prevalentes en los seres humanos [29,30], y también se ha recuperado a partir de perros, cerdos y animales del parque zoológico [3,20,21,23]. De forma similar, las cepas del ribotipo 106 también se encuentran con frecuencia en Europa (incluyendo España) y Norteamérica [25,26,28-31], mientras que, hasta donde nosotros sabemos, la prevalencia de los ribotipos 154 y 430 permanece desconocida. Los aislamientos no toxigénicos pertenecían al ribotipo 010, que comúnmente se aísla de perros y gatos [3,4,6,9,14,32].
A pesar del reciente desarrollo de nuevas alternativas terapéuticas, el metronidazol permanece como un pilar fundamental para el tratamiento inicial de la infección leve o moderada de C. difficile en seres humanos [33]. Este medicamento también se utiliza ampliamente en medicina veterinaria para el tratamiento de diversas enfermedades entéricas e infecciones por protozoos [34]. Aunque la mayoría de las cepas de C. difficile son todavía susceptibles al metronidazol, el número de casos de cepas humanas y animales con una sensibilidad reducida a este antibiótico está aumentando [35]. Sin embargo, el fenotipo resistente es en la mayoría de casos heterogéneo e inestable. En el presente estudio, siete aislamientos obtenidos de diferentes perros mostraron resistencia estable al metronidazol.
Finalmente, uno de los perros incluido en el presente estudio dio diferentes ribotipos en dos muestreos, lo que indica la eliminación de una cepa y la adquisición de otras o bien la colonización policlonal (es decir, la colonización por diferentes cepas), ya que solo se seleccionó una única colonia para una caracterización adicional de cada cultivo primario. También se observó la recuperación de dos o más ribotipos de un mismo animal en un estudio previo sobre la presencia en perros de C. difficile [3]. Además, la muestra fecal obtenida de otro perro produjo dos aislamientos del mismo ribotipo que mostraron diferencias importantes en su susceptibilidad al metronidazol in vitro (uno de los aislamientos fue clasificado como susceptible y el otro como resistente). En cualquier caso, ya que estos últimos aislamientos no fueron posteriormente genotipados por otras técnicas con mayor poder discriminatorio que el ribotipado (como el número de repeticiones en tándem de múltiples loci [multi-locus variable-number tandem-repeat analysis, MLVA] o la secuenciación del genoma completo [36]), no podemos excluir su naturaleza policlonal.
En conclusión, los resultados de este estudio no solo confirman que el perro puede actuar como reservorio de ribotipos de Clostridium difficile que se asocian con enfermedades humanas y que muestran resistencia a múltiples antibióticos, sino que también sugieren que esta especie animal podría tener un papel en la dispersión de cepas con resistencia estable al metronidazol. Dado el uso generalizado de metronidazol en la práctica de pequeños animales, la prevalencia y la relevancia clínica de la resistencia estable a metronidazol de C. difficile en el ámbito veterinario merece más investigación.
Fuente: Portal Veterinaria
